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微生物限度檢查操作

更新時(shí)間:2016-02-18   點(diǎn)擊次數(shù):2013次

微生物限度檢查操作的若干問題
除微生物制劑外,藥品微生物限度檢查與藥品中有效成分的含量測定顯著不同,其檢查對象具有以下特點(diǎn):
活體易變性
菌細(xì)胞在藥品中處于不穩(wěn)定狀態(tài),可隨存放時(shí)間延長死亡,也可在適宜條件下增殖。一批液體制劑若不含防腐劑,它可能是出廠時(shí)合格,貯存時(shí)不合格,zui終又可能“合格”。當(dāng)保存條件穩(wěn)定時(shí),其污染量在一定時(shí)間內(nèi)處于動態(tài)平衡,總體污染狀況可以標(biāo)準(zhǔn)化的條件予以正確評估。
分布不勻
除產(chǎn)品在生產(chǎn)前期污染外,通常是局部的。一批產(chǎn)品中不同瓶(盒)中污染狀態(tài)會出現(xiàn)差異,其污染量特別是致病菌通常是少量的。檢驗(yàn)樣品的代表性有賴于合理的抽樣方法。
多數(shù)處于受損傷狀態(tài)
藥品中污染的微生物,受到原料處理、加工等過程的影響,或者藥品本身對微生物的抑殺作用,使其受到一定程度的損傷,這些受傷的微生物用一般的方法檢查,往往會出現(xiàn)假陰性或計(jì)數(shù)偏低的結(jié)果。
生態(tài)環(huán)境多樣復(fù)雜
污染菌的來源多樣,種類多樣,加之藥品種類繁多、劑型成分復(fù)雜,同一種菌在不同的藥劑中所測得的結(jié)果各不相同。
微生物限度檢查必須遵循以下原則:
1樣品正式檢驗(yàn)前必須保持原污染狀態(tài)。防止第二次污染和防止污染微生物的繁殖或死亡。
2應(yīng)有適當(dāng)?shù)墓┰囈褐苽浞椒?。供試液的正確制備是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。
3檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠
4檢驗(yàn)結(jié)果判斷無誤
作好微生物限度檢驗(yàn),檢驗(yàn)人員的職業(yè)品德和業(yè)務(wù)素質(zhì)至關(guān)重要。
建立科學(xué)的質(zhì)量保證體系,是獲取檢驗(yàn)結(jié)果正確可靠的基本保證。

一、檢驗(yàn)樣品保持原污染狀態(tài)
防止再污染無菌技術(shù)
設(shè)備和無菌操作(略)
防止再繁殖或死亡
21 樣品應(yīng)為未開啟的原包裝、檢驗(yàn)前保存條件應(yīng)與藥品貯存條件相同。
22從樣品接觸稀釋劑至接種(注皿)應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成,對多批樣品應(yīng)分段接種(注皿)。
23抑菌性藥品供試液制備,應(yīng)盡可能縮短制備時(shí)間并注意污染微生物的減失(離心、溫度)。

二、供試液制備

1稀釋劑藥典規(guī)定使用0.9%無菌氯化鈉及無菌磷酸鹽緩沖液,從保護(hù)菌細(xì)胞及有利菌細(xì)胞的恢復(fù)考慮,有必要研究改進(jìn)。
2量具衡器電子稱藥物天平感量應(yīng)小于0.1g
容器及吸管現(xiàn)無設(shè)備要求誤差小于1
吸管1ml分度值0.01ml,10ml分度值0.1ml
口徑不大于2mm
稱(吸)量固體、半固體10g
液體10ml
膜劑以面積計(jì)
分散方式勻漿儀30005000rpm24min
4
稀釋固體加稀釋劑100ml,液體加稀釋劑90ml,與國外藥典規(guī)定有差別。樣品應(yīng)充分均質(zhì)或乳化分散在稀釋劑中。對膠囊、膠劑等先打碎再溶解,對栓劑及油劑加適量分散劑,對油膏基質(zhì)軟膏加適宜乳化劑,如司盤、單硬脂酸甘油酯、吐溫等。
抑菌性樣品:
菌數(shù)測定,目前未規(guī)定處理方法
控制菌檢查,水溶性樣品:薄膜過濾、稀釋、離心沉淀
混懸液:二次離心
乳濁液:離心法
滅活劑的使用需依品種分別測試
處理時(shí)間宜控制在zui短時(shí)間內(nèi)
稀釋方法:吸液在離液面25cm處,放液離第二管液面不高于1cm,管內(nèi)混和吹打不少于10次,瓶內(nèi)振蕩混合不少于15s’。

三、方法和結(jié)果判斷

目前我國微生物限度檢查在方法標(biāo)準(zhǔn)化、靈敏度、科學(xué)性等方面與國外相比還存在一定差距,質(zhì)量保證體系的建立尚須作許多工作,現(xiàn)就我國現(xiàn)行方法提出一些問題共同討論。
菌數(shù)測定
我國采用平板稀釋法
11 稀釋度我國現(xiàn)規(guī)定稀釋級至少為三級
三級稀釋度的平均菌落生長數(shù)互為比照,能較為真實(shí)反映藥品中的污染菌量,防止錯(cuò)誤判斷,對于抑菌性藥品的菌數(shù)確定尤其重要。在10-110-2稀釋級不生長或少生長而在103級平板生長的情況并不少見。
12陰性對照檢查用具、稀釋劑、培養(yǎng)基及檢測環(huán)境的本底狀態(tài)以確認(rèn)樣品檢驗(yàn)的可靠性,是檢驗(yàn)質(zhì)量保證的重要步驟。
13培養(yǎng)基培養(yǎng)基的質(zhì)量是菌數(shù)測定的關(guān)鍵因素。
培養(yǎng)基注皿量及培養(yǎng)溫度對菌數(shù)測定有影響
14點(diǎn)計(jì)實(shí)際工作中注意細(xì)菌、酵母菌及霉菌的區(qū)別,細(xì)菌與藥渣的區(qū)別,霉菌與藥物結(jié)晶的區(qū)別。
菌落蔓延、重疊、連線生長情況的處理。
不能作為計(jì)數(shù)依據(jù)的幾種情況:三級平板菌落數(shù)不能顯示差別;當(dāng)平板平均菌數(shù)>15時(shí),二個(gè)平板菌落數(shù)相差1倍以上;平板平均菌落數(shù)≤15時(shí)二個(gè)平板的菌落數(shù)不在0-4''1-7''2-9''3-10''4-12''5-14''6-15范圍內(nèi)。
15報(bào)數(shù)報(bào)數(shù)規(guī)則的有關(guān)問題
細(xì)菌數(shù)測定報(bào)數(shù)的舉例:
①、一個(gè)稀釋級平均菌落數(shù)在30300時(shí):
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
13281101320
26448
1024400
322056
繼續(xù)稀釋
②、二個(gè)稀釋級平均菌落數(shù)在30300時(shí):
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
1280428比值≤2''102102平均值3500
230013034
比值2''1021300
③、三個(gè)稀釋級平均菌落數(shù)均不在30300時(shí):
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
12801203710212000
229022040
10210-3平均值31000
④、各稀釋級平均菌落數(shù)均不在30300時(shí)
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
1多不可計(jì)1560342103340000
2310248
1022400
328124
10-1280
412121

培養(yǎng)基稀釋法
5121
⑤、菌數(shù)報(bào)告不合理的舉例
10-110-210-3處理原則報(bào)告數(shù)
1302802010210-1102300
2422908010
310-210229000
3322404210
310-2取平均值33000
16 
復(fù)試復(fù)試是對菌數(shù)結(jié)果在合格邊緣的一種處理辦法。
17日常工作中幾種情況的處理:液體制劑發(fā)生爆破(或塑瓶膨脹)而常規(guī)檢查方法“合格”;相似菌落在二種平板上同時(shí)生長;對生長菌落數(shù)明顯不符合稀釋分布規(guī)律者。
2控制菌檢查
藥品中污染的控制菌數(shù)量少、分布不勻,且多受藥物影響呈亞致死狀態(tài),適宜的增菌培養(yǎng)方法和高靈敏度的培養(yǎng)基是提高陽性檢出率的關(guān)鍵。
為了保證試驗(yàn)方法的可靠性,藥典規(guī)定的陽性對照與陰性對照試驗(yàn)是必須的。陽性對照菌須加入供試液中與供試品檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。在試驗(yàn)中,當(dāng)已知陽性菌不能檢出時(shí),該項(xiàng)控制檢驗(yàn)結(jié)果無效,須認(rèn)真研究原因,重點(diǎn)考慮藥品的抑菌作用并制定滅活處理方法。
目前藥典規(guī)定的陽性對照菌種,多為具有毒力的致病菌如乙型副傷寒沙門氏菌,破傷風(fēng)梭菌等,為防止試驗(yàn)中污染供試品檢驗(yàn)環(huán)境,作陽性菌對照試驗(yàn)時(shí)應(yīng)與供試品檢驗(yàn)分開進(jìn)行,使用操作間或接種臺。
1)大腸桿菌檢查(略)
2)沙門氏菌檢查
 增菌培養(yǎng)預(yù)增菌營養(yǎng)肉湯
增菌四硫磺酸鹽煌綠肉湯
沙門菌在增菌培養(yǎng)液中呈均勻混濁、無菌膜、無沉淀。
 分離培養(yǎng)DHL''SS;EMB''MacC
疑似菌落為透明或半透明,無色(或微顯培養(yǎng)基色)
在含H2S指示系統(tǒng)培養(yǎng)基上菌落中心呈黑色
發(fā)酵乳糖的亞屬Ⅲ其菌落呈乳糖指示系統(tǒng)顏色
 初步鑒別疑似培養(yǎng)物在TSI上為K/AH2S+,K/AH2S-,A/AH2S
④生化反應(yīng)
H2S賴氨酸脫羧酶靛基質(zhì)脲酶
沙門菌屬反應(yīng)++---
+++少見--
-+---
⑤血清凝集試驗(yàn)直接凝集試驗(yàn)+
或煮沸30分鐘后凝集試驗(yàn)+
⑥結(jié)果判斷革蘭氏陰性桿菌④及⑤兩項(xiàng)均符合報(bào)告檢出沙門菌
當(dāng)④及⑤兩項(xiàng)中一項(xiàng)不符合時(shí)進(jìn)一步檢驗(yàn)
當(dāng)④及⑤兩項(xiàng)均不符合時(shí)報(bào)告未檢出沙門菌
3)金黃色葡萄球菌檢查
 增菌培養(yǎng)營養(yǎng)肉湯、亞碲酸鈉肉湯,均勻混濁,稍有沉淀
 分離培養(yǎng)卵黃氯化鈉平板,甘露醇氯化鈉平板,血平板
疑似菌落金黃色、圓形凸起,邊緣整齊,光滑濕潤,有乳濁圈(卵黃氯化鈉平板),黃色環(huán)(甘露醇氯化鈉平板)、透明溶血環(huán)(血平板)
 生化試驗(yàn)及染色血漿凝固酶試驗(yàn)陽性
G+球菌
 結(jié)果血漿凝固酶試驗(yàn)陽性,G+球菌,報(bào)告陽性檢驗(yàn)結(jié)果
4)銅綠假單胞菌
增菌培養(yǎng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基液體表層生長旺盛、有菌膜
分離培養(yǎng)溴代十六烷*胺平板
疑似菌落灰白色扁平、圓或無定形,邊緣不齊,周邊呈擴(kuò)散現(xiàn)象,典型者菌落周圍呈藍(lán)綠色。
生化試驗(yàn)及染色G-桿菌
①氧化酶試驗(yàn)+
②綠膿菌素試驗(yàn)+
③硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)+
④明膠液化試驗(yàn)+
41℃生長試驗(yàn)+
結(jié)果G-桿菌①及②陽性作出陽性結(jié)果報(bào)告
G-桿菌①陽性②陰性
則③、④、⑤皆為陽性作出陽性結(jié)果報(bào)告
5)破傷風(fēng)梭菌檢查
為厭氧梭菌,須以厭氧培養(yǎng)法檢查
厭氧培養(yǎng)方法冷觸媒法
焦性沒食子酸法
增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)產(chǎn)氣、臭味、肉渣消化
染色鏡檢典型者為鼓槌樣芽孢桿菌
毒力試驗(yàn)當(dāng)增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)出現(xiàn)疑似培養(yǎng)物時(shí)須作毒力試驗(yàn),當(dāng)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)疑似破傷風(fēng)梭菌者,*次毒力試驗(yàn)陰性時(shí)應(yīng)連續(xù)進(jìn)行二次增菌產(chǎn)毒培養(yǎng),并接種新霉素血平板,刮取疑似菌作增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)。
結(jié)果毒力試驗(yàn)陽性,不論鏡檢是否發(fā)現(xiàn)疑似破傷風(fēng)梭菌,均作出陽性檢驗(yàn)報(bào)告


平板細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)置信區(qū)間

菌落總數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 95%置信區(qū)間 99置信區(qū)間 范圍
   下限   上限  下限  上限 
1 05000 05000 0013 1844 0003 2639 
2 10000 07071 0121 2786 0052 3715 
3 15000 08660 0309 3612 0169 4637 0-4
4 20000 10000 0545 4384 0336 5489 
5 25000 11180 0812 5127 0539 6297 
6 30000 12247 1101 5834 0768 7075 
7 35000 13229 1407 6530 1019 7830 1-7
8 40000 14142 1727 7211 1286 8567 
9 45000 15000 2058 7882 1566 9289 
10 50000 15811 2398 8542 1858 9999 2-9
11 55000 16583 2746 9195 2161 10699 
12 60000 17321 3100 9841 2472 11390 
13 65000 18028 3461 10481 2790 12072 3-10
14 70000 18708 3827 11115 3115 12748 
15 75000 19365 4198 11745 3447 13410 4-12
16 80000 20000 4573 12370 3783 14082 
17 85000 20616 4952 12992 4125 14741 
18 90000 21213 5334 13609 4472 15395 5-14
19 95000 21794 5720 14224 4822 16045 
20 100000 22361 6108 14835 5177 16691 6-15
21 105000 22913 6500 15444 5535 17334 
22 110000 23452 6894 16050 5896 17973 
23 115000 23970 7290 16654 6260 18609 7-17
24 120000 24495 7689 17256 6628 19242 
25 125000 25000 8089 17855 6998 19873 8-18
26 130000 25495 8492 18452 7370 20509 
27 135000 25981 8897 19040 7745 21125 9-19
28 140000 26458 9303 19642 78123 21740 
29 145000 26926 9711 20234 8052 22369 10-20
30 150000 27386 10120 20824 8884 22983 

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